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何首乌颗粒剂对阿尔茨海默病模型大鼠学习记忆及miRNA-101 表达的影响 添加时间： 2019-03-01
本文引用：高雯华，袁梦石，曾倩柔，范钊坤.何首乌颗粒剂对阿尔茨海默病模型大鼠学习记忆及 miRNA-101 表达的影响[J].湖南中医药大学学报，
2018，38（10）：1120-1124.
何首乌颗粒剂对阿尔茨海默病模型大鼠学习记忆及miRNA-101 表达的影响
高雯华 1，袁梦石 2*，曾倩柔 1，范钊坤 3
（1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007； 3.浙江省中医院，浙江 杭州 310006）
〔摘要〕 目的 研究何首乌对阿尔茨海默病模型大鼠学习记忆能力及双侧海马区 miRNA-101 表达的影响，并探讨其作用机制。方法 将 120 只 SD 大鼠随机分为 4 组，每组 30 只，分别为假手术组、石杉碱甲组、模型组、中药组。 除假手术组外，使用化学试剂冈田酸(OA)注射 SD 大鼠杏仁核部位，形成阿尔茨海默病模型。 造模后每组分别予以相应干预（假手术组与模型组均灌等容量生理盐水）。 干预 21 d 结束后，运用 Morris 水迷宫作为行为学检测方法，评测大鼠学习记忆能力，行为学观察共进行 5 d，结束后处死实验大鼠，取双侧海马运用 RT-PCR 进行 miRNA-101 半定量检测。 结果 经 21 d 干预后，与模型组相比，中药组与石杉碱甲组的阿尔茨海默病模型大鼠的学习记忆能力均更强， 其差异具有统计学意义 （P<0.01）； 与模型组相比， 中药组与石杉碱甲组大鼠双侧海马区 miRNA-101 的相对表达量增加（P<0.01）。 结论 何首乌能显著改善阿尔茨海默病模型大鼠的学习记忆能力，对阿尔茨海默病有一定的治疗作用；通过提高模型大鼠海马区 miRNA-101 的含量来改善症状可能是其作用机制之一。
〔关键词〕 何首乌；阿尔茨海默病；学习记忆能力；miRNA-101
〔中图分类号〕R285.5；R741 〔文献标志码〕A 〔文章编号〕doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2018.10.006
Effect of Heshouwu Granule on Learning and Memory and miRNA-101 Expression in a Rat Model of Alzheimer's Disease
GAO Wenhua1, YUAN Mengshi2*, ZENG Qianrou1, FAN Zhaokun3
(1. Hunan University of Chinese Medicine, Changsha, Hunan 410208, China; 2. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha, Hunan 410007, China; 3. Zhejiang Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, Hangzhou, Zhejiang 310006, China)
〔Abstract〕 Objective To study the effect of Fallopia multiflora on learning and memory abilities and miRNA-101 expression in bilateral hippocampus in a rat model of Alzheimer's disease, and to explore its mechanism. Methods A total of 120 Sprague- Dawley rats were randomly and equally divided into four groups: sham-operation group, control (huperzine A) group, model group, and traditional Chinese medicine (TCM) group. To establish a model of Alzheimer's disease, okadaic acid was injected into the amygdala of rats in all the groups except for the sham -operation group. Each group received the corresponding intervention after model establishment (the sham-operation group and the model group were given the same amount of normal saline). After 21 days of intervention, Morris water maze was used for the behavioral test to evaluate the learning and memory abilities of rats.
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〔收稿日期〕2017-11-30
〔基金项目〕湖南省中医药管理局资助课题（2015107）。
〔作者简介〕高雯华，女，在读硕士研究生，研究方向：神经系统疾病。
〔通讯作者〕* 袁梦石，男，教授，硕士研究生导师，E-mail：passy1971@qq.com。
After 5 days of behavioral observation, the rats were sacrificed and the bilateral hippocampus was collected for semi - quantitative measurement of miRNA -101 using RT -PCR. Results After 21 days of intervention, the TCM group and the control group had significantly better learning and memory abilities and significantly higher relative expression of miRNA-101 in the bilateral hippocampus than the model group (all P<0.01). Conclusion Fallopia multiflora can substantially improve the learning and memory abilities of the rat model of Alzheimer's disease, suggesting a certain therapeutic effect against Alzheimer's disease. The symptoms are improved probably by increasing the content of miRNA-101 in the hippocampus of rats.
〔Keywords〕 Fallopia multiflora; Alzheimer's disease; learning and memory abilities; miRNA-101
阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是老年性痴呆最常见的一种，属于中枢神经系统退行性疾病，其主要临床特征为学习、记忆能力的减退以及认知功能的受损，伴有大脑功能全面减退的各种临床症状。 本病起病隐匿，呈进行性进展，病程缓慢。近几年的调查研究表明，现阶段随着老龄化趋势的加重，在世界范围内 AD 的患病率正在逐年增加，而AD 在我国老年人中的患病率高达 5%~8%[1]。 用中医药手段防治 AD 是重要的临床研究方向之一。
AD 的病因与发病机制尚未完全明确，当前研究表明 APP(淀粉样前体蛋白)是形成 AD 重要因素— “老年斑”核心成分 Aβ[2]的前体物质，而这一环节又有许多调控因子参与其中， 如 miRNAs，miRNAs 在AD 的发生发展中起着重要的调节作用。 其中miR- NA-101 可负性调控 APP 的生成，进而起到减少 Aβ 异常沉积的作用[3]。
根据临床表现及发病特点，中医多将 AD 作为“呆病”“癫病”“健忘”“郁证”等范畴来论述。 本病的病位在脑，属本虚标实，其病因多责于年老体衰，气血不足，脏器亏虚，气血津液运行乏力，气、火、痰、瘀等病理产物堆积，上阻于清窍所致。 脑为髓海，是认知的物质基础，同时脾主生化为后天之本，心气不足则神不归宅，肾精不足则髓海失养，肝阳上亢则脑络不利， 中医在治疗 AD 时常常根据具体症状进行辨证施治。
为明确何首乌对于 AD 的治疗效果及作用机制，研究团队通过动物实验进一步分析研究何首乌治疗 AD 的理论基础。
1 实验材料
1.1 实验动物
120 只 SPF 级健康成年 Sprague-Dawley (SD)大鼠[动物质量许可证号：CSXK(湘)2013-0004]，12 月
龄，（250±50） g，雌雄各半，购于湖南中医药大学第一附属医院中心实验室动物实验中心。
1.2 主要药物与试剂
何首乌颗粒剂，购于湖南中医药大学第一附属医院中药房（广州一方颗粒有限公司生产）；石杉碱甲（商品名：双益平）购于上海复旦复华药业有限公司， 规格：50 μg/片， 产品批号为：H10960133； 水合氯醛购于青岛宇龙海藻有限公司， 规格：500 g/瓶， 产品批号为：国药准字号 H37022673；冈田酸(OA)购于上海泰坦科技股份有限公司，规格：50 mg/瓶，产品批号为：P1117509；Trizol 试剂盒产于美国 Invitrogen 公司，规格：100 mL/瓶，产品货号为：15596026；miR- NA 试剂盒购于北京经科宏达生物技术有限公司，规格：10 mL/盒，产品货号为：29066501。
1.3 主要仪器与设备
脑立体定位仪（日本 Narishige SN-3 型），1 μL 微量注射器（上海精密仪器厂），台式高速离心机（德国 eppendorf）， 超低温冰箱（ 中科美菱）， 荧光定量PCR 仪、 荧光PCR 板、 荧光定量仪均为美国 Thermo 公司提供，天平琼脂糖电泳槽（北京六一），Morris 水迷宫视频分析系统（北京众实迪创科技发展有限公司）。
2 方法
2.1 实验动物分组
120 只 SD 大鼠雌雄各半，常规饲养 1 周。 然后按照随机区组法将 60 只雌性和 60 只雄性分别进行随机分组，分为假手术组、模型组、石杉碱甲组与中药组，共 4 组，每组 30 只。
2.2 造模方法
大鼠腹腔注射 20%戊巴比妥钠 (40 mg/kg) 麻醉后，固定脑立体定位仪上， 颅顶正中矢状切开，行立体定位(前囟后 3.0 mm，左右侧方为 4.8 mm， 颅骨表面下 8.8 mm)。 假手术组:用 5 μL 注射器吸取生
理盐水 1 μL,于 10 min 内缓慢注入杏仁核。 用微量注射器向大鼠杏仁核部缓慢注射[4]，其中模型组、石杉碱甲组、 中药组实验大鼠均予以注射 OA 1 μL
（100 mg/μL）， 造模后根据行为学观察结果评判是否造模成功。
2.3 干预方法
造模完成第 2 天开始给药， 中药组予以 25 g/
（kg·d）何首乌颗粒剂溶液（1 mL 溶液即等同于 1g何首乌颗粒剂）， 石杉碱甲组予以 0.3 mg/（kg·d）石杉碱甲溶液 （1 mL 溶液即等同于 1 mg 石杉碱甲片剂），其余 2 组均予等容量生理盐水，每日 2 次（上午 9 点、下午 4 点）给药。 连续干预 21 d。
2.4 行为学观测
连续干预 21 d 后参照 Morris 水迷宫实验方法[5] 观察大鼠学习和记忆能力，评价造模是否成功，并从行为学角度评价石杉碱甲与何首乌对 AD 模型大鼠学习和记忆能力的影响。
2.5 miRNA-101 RT-PCR 半定量
大鼠双侧海马取材：于 21 d 灌胃及 5 d 水迷宫实验结束后将各组实验大鼠予 10%水合氯醛腹腔注射，麻醉后以断颈法处死大鼠，迅速取出大脑，在冷冻台上进行分双侧海马的分离：找到额极，向后约3 mm 取出额叶，由脑中裂向两边约 3 mm、枕叶向前
约 3 mm，钝性剥离双侧海马，存于超低温冰箱内。
大鼠双侧海马区 miRNA-101 RT-PCR 半定量[6]： Trizol 法提取海马区总 RNA，行 RNA 琼脂凝胶电泳。以组织总 RNA 为模板取 2 μg 逆转录 cDNA，42 ℃ 孵育 50 min，85 ℃孵育 5 min 后终止反应。 在网
址 http://www.mirbase.org/cgi-bin/query.pl?terms=214 中搜索 miRNA 序列，primer5 软件设计引物，由上海生工合成。 设计引物如下： 上游引物序列为 5'- AAAGAAAGCCGCCCACCT-3'， 下游引物序列为 5'- GGTCCATCTATGTTGGGGGTA-3';GAPDH 的上游引物序列为 5'-GGATTTGGTGTCG-TATTGGGC-3'，下 游引 物 序 列 为 5'-CGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3'。
定量 PCR 扩增条件为 95 ℃10 min，95 ℃15 s，60 ℃
60 s，40 个循环。 2-ΔΔCt 反映各样品相对于石杉碱甲组样品目的基因的表达水平，△Ct=目的△Ct-内参
△Ct， -ΔΔCt =( 石杉碱甲组）ΔCt 平均值- 各样品
ΔCt，每个样本重复进行 3 次实验后进行统计分析。
2.6 统计学分析
数据采用 SPSS 22.0 软件进行统计分析， 计量资料以“x±s”表示，先进行正态性和方差齐性检验，满足正态性时，采用单因素方差分析，组间比较若方差齐时采用方差分析-LSD 检验，方差不齐时用方差分析 Games-Howell 检验；不满足正态性时选择秩和检验；以 P＜0.05 表示差异具有统计学意义。
沈阳办事处