刺五加苷 E 对穹窿-海马伞损伤大鼠学习记忆能力及海马神经元可塑性的影响

徐娅丽¹ ， 杜万雪¹ ， 黄德斌^2*

( 湖北民族学院医学院，湖北 恩施 445000)

摘要: 目的 探索刺五加苷 E 对穹窿-海马伞损伤大鼠学习记忆能力及海马神经元可塑性的影响。方法 120 只大鼠随机分为对照组、模型组、假手术组及刺五加苷 E 低、中、高剂量组 ( 100、200、500 mg / kg) ，每组 20 只。第 7、21 天分别测定寻找平台潜伏期和错误次数后，ＲT-PCＲ、ELISA 检测锥体细胞凋亡率、c-fos 基因表达、Na +  -K +  -ATP 酶活性。结果 与模型组比较，刺五加苷 E 组寻找平台潜伏期、错误次数显著减少 ( P ＜ 0. 05) ，Na + -K + -ATP 酶活性、正常锥体细胞数量显著增加 ( P ＜ 0. 05) ，锥体细胞密集度和排列方式、神经纤维缠结、胶质细胞增生、核固缩明显改善 ( P ＜ 0. 05) ，第 7 天 c-fos 相对灰度值显著增加 ( P ＜ 0. 05) ，第 21 天恰好相反 ( P ＜ 0. 05) 。结论 刺五加苷 E 可剂量依赖性地改善穹窿-海马伞损伤大鼠学习记忆能力，其机制可能与增强 Na + -K + -ATP 酶活性、调控 c-fos 基因表达、阻止海马神经元损伤并促进其可塑性有关。

关键词:  刺五加苷 E; 学习记忆能力; 海马神经元; 可塑性; 穹窿-海马伞损伤

中图分类号: Ｒ285. 5 文献标志码: A 文章编号: 1001 － 1528( 2018) 11 － 2368 － 06

doi: 10. 3969 / j． issn． 1001 － 1528. 2018. 11. 002

Effects of eleutheroside E on memory and learning activities，hippocampal neu- ron plasticity of rats with fornix-fimbria lesions

XU Ya-li¹ ，  DU Wan-xue¹ ，  HUANG De-bin^2*

( Medical School，Hubei University for Nationalities，Enshi 445000，China)

ABSTＲACT: AIM     To  explore  the  effects  of  eleutheroside  E  on  memory  and  learning  activities，hippocampal neuron plasticity of rats with fornix-fimbria lesions．  METHODS    One hundred and twenty rats were randomly di- vided into control group，model group，sham operation group and eleutheroside E low-dose，medium-dose，high- dose groups ( 100，200，500 mg / kg) ，20 rats in each group．  After the determination of searching platform latency and error frequency on the 7^th and 21^st days，respectively，ＲT-PCＲ and ELISA were applied to detecting pyramidal cell apoptosis  rate，c-fos gene  expression  and  Na ⁺ -K ⁺ -ATPase  activity．   ＲESULTS     Compared  with  the  model group，the  eleutheroside E groups demonstrated significantly reduced searching platform latency and error frequency     ( P ＜ 0. 05) ，markedly increased Na ⁺ -K ⁺ -ATPase activity and normal pyramidal cell number ( P ＜ 0. 05) ，obvi-

ously improved pyramidal cell intensity and arrangement style，neurofibrillary tangles，glial cell proliferation， karyopyknosis ( P ＜ 0. 05) ，and c-fos relative gray value was significantly increased on the  7^th  day ( P ＜  0. 05) ， which  was just on  the  contrary  on  the  21^st  day ( P ＜ 0. 05) ．    CONCLUSION Eleutheroside E can improve the memory  and  learning  activities  of  rats  with  fornix-fimbria  lesions  in  a  dose-dependent  manner，whose   mechanisms may be related to enhancing Na ⁺ -K ⁺ -ATPase activity，regulating c-fos gene expression，preventing hippocampal neuron damage and promoting its plasticity．

KEY  WOＲDS:  eleutheroside  E;  memory  and  learning  activities;  hippocampal  neuron;  plasticity;  fornix-fim- bria lesions

收稿日期: 2018-03-17

基金项目: 国家自然科学基金项目 ( 81360654) ; 湖北省教育厅基金资助项目 ( D20111903)

作者简介:  徐娅丽 ( 1991—) ，女，硕士生，研究方向为中医药防治脑病。Tel: 18972262957，E-mail: yl161003@ 163． com

*  通信作者:  黄德斌 ( 1966—) ，男，硕士，教授，研究方向为神经药理。Tel:  ( 0718)  8430479，E-mail: hdb66910@ 163． com

研究表明，海马神经元突触可塑性的变化与阿尔茨海默病密切相关^［1-2］。目前已从行为学、胆碱 能学等方面探索出很多有效的治疗方法^［3］，其中减少神经突触丢失、促进突触可塑是关键措施^［1-2］。刺五加具有抗疲劳、改善睡眠、增强学习 记忆能力等作用^［3-5］，可使运动中枢与感觉中枢更 趋于稳定，提高大脑工作效率^［6］。前期课题组发 现，刺五加总苷能改善衰老大鼠模型学习记忆能力^［3，6］，本实验将探索刺五加苷 E 对穹窿-海马伞损伤大鼠学习记忆能力及海马神经元可塑性的影响。

1 材料

SPF 级雄性 SD 大鼠 120 只，24 月龄，体质量( 480 ± 20) g，由三峡大学实验动物中心提供 ( 动物编号 42010200000310-304 ) 。Morris 水迷宫、牙科钻、ZS-B / S 脑立体定位仪 ( 北京众实迪创科技发展有限责任公司) 。刺五加苷 E ( 批号 MUST- 11082410，含有量 98% ) 、Na + -K ^{+ -ATP  酶试剂盒( 南京建成生物工程研究所) ; H-600Ⅳ电子显微镜 ( 美国 Amary 公司) 。}

2 方法

2. 1 分组、建模及给药 经水迷宫测试筛选，实验前大鼠适应性训练 1 周，温度 ( 24 ± 3 ) ℃ 、相对湿度 ( 60 ± 5 ) % ，之后将其随机分为对照组、模型组、假手术组及刺五加苷 E  低、中、高剂量组，每组 20 只。采用穹窿-海马伞损伤法造模^［6-7］， 模型组、刺五加苷 E 组大鼠腹腔注射 4% 水合氯醛麻醉，脑立体定位仪固定，颅顶备皮，定前囟零点 钻孔 ［参照大鼠脑立体定位图谱，前囟后 ( AP)

3. 5 mm， 左右旁开 ( ML ) 2. 0 mm， 硬脑膜下( H)  2. 7  mm］，去颅骨，挑开硬脑膜，按上述坐标从脑冠状面用自制刀片 ( 宽 1 mm，厚 0. 7 mm) 插入脑内切断穹窿-海马伞，缝合伤口;  对照组和假手术组大鼠不损伤穹窿-海马伞，直接缝合切口。实验开始后，刺五加苷 E 组大鼠腹腔注射 100、200、500  mg / kg 刺五加苷 E，对照组、模型组、假手术组大鼠腹腔注射等量生理盐水，每天 2 次。

2. 2 寻找平台潜伏期、错误次数测定^［6-7］ 均于每天上午 9:  00  ～ 10:  00、晚上 21:  00  ～ 22:  00  训练，各时间段训练 4 次，每次 60  s。将大鼠随机选择入水点面向池壁放入水中训练，若 120  s 内无法找到平台，则对其进行导引。分别于造模前后药物 干预第 7、21 天测定寻找平台潜伏期、错误次数， 然后各组大鼠处死 10 只，用于观察海马 CA3 区锥

体细胞凋亡率、神经可塑性、Na + -K ^{+ -ATP 酶活性、c-fos 基因表达。}

2. 3 海马 CA3 区锥体细胞凋亡观察^［8-^9］ 进行

“2. 2” 项下操作后，大鼠腹腔注射 4% 水合氯醛麻醉，心脏取血，断头处死，开颅取脑，分离完整海马，生理盐水洗净后从前端连续对 CA3 区冠状切片各 3 张 ( 5 ～ 8 μm) ，置于离心管中， － 85 ℃ 下保存备用，用于检测 Na + -K ^{+ -ATP 酶活性及 c-fos 蛋白、mＲNA 表达。}

2. 4 海马 CA3 区突触形态可塑性观察^［8-9］ 进行“2. 2” 项下操作后，大鼠腹腔注射 4% 水合氯醛麻醉，心脏取血后断头处死，取出海马备用。按脑立体定位图取海马 CA3 区，平均分为两部分，一部分切成 1 mm³ 小块固定 2 h ( 2. 5% 戊二醛溶液) ， 环氧树脂-Epon812 包埋，切成 60 nm 超薄片，230 目铜网捞片后双重电子染色 ( 0. 1% 醋酸铀 + 3% 柠檬酸铅) ，透射电镜下进行观察和图片采集，包括突触前后膜、致密带、至少 3 个突出囊泡。然后，Guldner 法^［6］ 测量突触密度 ( Nd，个/ μm² ) 、突触面密度 ( SD，μm³ ) 、突触后致密物平均厚度

( PSD) 、平均面积 ( Aa，μm² ) ，计算公式为 Nd =

8ENa / π² ，Na = ∑Nx  / ∑Aa，PSD 厚度用图像分析软件 Image  Pro  Plus  6. 0  计算， 其中 Na  为每1 μm² 的突触数，E 为 PSD 的倒数，Nx 和 Aa 分别为每张照片 ( 1  × 10  000 )  的突触数和面积( μm² ) ; 另一部分用 10% 甲醛固定，脱水，石蜡包埋，切片，HE 染色病理观察。

2. 5 红细胞膜与海马 CA3 区 Na + -K ^{+ -ATP 酶活性检测［3，6］} 大鼠采血后肝素抗凝，4 ℃ 下保存。测定红细胞膜 Na + -K ^{+ -ATP 酶活性时，低温离心3 min ( 3  000   r / min ) ， 加 入 40  倍 Tris-Cl   破 膜 液( 10 mmol / L) 破坏细胞膜，离心 ( 15 000 r / min) 6 min后弃上清，得到红细胞膜酶，将 ATP 液以 ATP}

检测裂解液稀释成 3 个 对 照 浓 度 ( 20、50、100 μmol / L) 。另取海马 CA3 区组织分为两部分， 一部分匀浆器匀浆，3  次离心后取上清， 检测Na + -K ^{+ -ATP 酶活性，具体操作按试剂盒说明书进行。}

2. 6  海马 CA3 区总 ＲNA 提取、鉴定及 c-fos 基因扩增^［2，10］ Trizol 试剂提取海马 CA3 区组织总ＲNA，ＲT-PCＲ 法半定量分析海马 CA3 区 c-fos mＲ- NA 水平，吸取该区组织 60 ～ 80 mg，加入 1 mL Tr-

izol，匀浆器匀浆，匀浆移入 1. 5 mL 离心管静置

3 min ( 25 ℃) 后，低温离心 10 min ( 4 000 r / min，

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